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细菌脂肪酸的提取与分析

2018/9/10 10:22:28      点击:

      试剂:  0.3%甲醛、6 mo1/1 HC1-CH3OH溶液、三氯甲烷方法:  GC- -MS 联用分析测定,步骤如”下:
(1)菌体的培养与收集

      I组实验菌株用YPD液体培养基培养,在培养基中添加一定量的抗冻保护剂,接种后放入30°C、150 r/ min的摇床中培养24 h。细胞振荡培养至生长对数中期,移取适量细胞悬浮液至-30°C冰箱冷冻7d,  取出30°C 下解冻5-10min,用0.3%甲醛灭活后,  4000r / min下离心5 min,  弃去上清液,用蒸馏水洗涤,离心收集细胞,-18C冷冻, 冷冻真空干燥制得千细胞后备用。

      空白样用0.3%甲醛灭活后,  4000 r/ min下离心5 min,弃去上清液,用蒸馏水洗涤,离心收集细胞,-18C冷冻 24h,冷冻真空千燥制得千细胞后备用。

      II组实验菌株用于面包冷冻面团的制备,添加抗冻保护剂,于-20C冷冻30d后取出解冻,取20g解冻后的面团,分散于180ml 无菌水中,震荡30min,  静置15min,离心并取上清液。用0.3%甲醛灭活后,  4000r / min下离心15 min,  弃去上清液,用蒸馏水洗涤,离心收集细胞,-18C冷冻,冷冻真空干燥制得干细胞后备用。空白样则不添加抗冻保护剂,其余处理方法-样。

(2)  脂肪酸的甲基化与提取

      取50 mg冻千细胞加入6 mol/1 HC1-CH3OH溶液2 m1,置100°C的条件下盐酸水解甲基化3 h,溶液呈现棕褐色(或黑褐色),取出,置室温下冷却。加入正己烷1.5m1振荡。经4000 r / min离心10min, 收集上清液再加入正已烷1.5m1 .抽提一次,合并两次.上清液,加入蒸馏水3ml,经4000r/ min离心10 min,收集上清液于离心管中。用流动N2吹千,加入10μ1三氯甲烷制备脂肪酸酯化液。

(3)薄层层析

      用玻璃毛细管取脂肪酸酯化液点在硅胶G-TLC薄层板上,以正已烷+无水乙醚(1+1)为展层系统,待层析液至硅胶板上缘后立即取出薄层板,风干。在UV254灯下检查制备的脂肪酸纯度与相对浓度。将脂肪酸甲酯带做好标记,轻轻刮下,用二乙醚抽提两次,经N吹千后加入0. 5ml无水甲醇振荡溶解,然后进行GC一MS分析。 
(4)GC--MS操作条件

    程序升温:初温130°C,  保持1 min;  终温280°C,维持min,升温速度7.6°C / min。  检测器温度250°C;载气(He)流速30ml / min; 分流比50: 1;流速(He)49. 9ml / min;进样量1μl。  (2)中质谱条280°C,质量扫描范围35-500。

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